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      聽(tīng)老師將講HPLC的計算

      發(fā)布時(shí)間: 2021-12-10  點(diǎn)擊次數: 2738次

                                                                       聽(tīng)老師將講HPLC的計算

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      HPLC中涉及到計算的,主要是流動(dòng)相配制和含量計算。RP-HPLC一般用緩沖鹽配合甲醇乙腈作為流動(dòng)相,計算主要涉及到如何配制流動(dòng)相的問(wèn)題。同時(shí)還要考慮到流動(dòng)相配制的數量問(wèn)題。HPLC計算主要運用外標法。內標法在HPLC分析中,運用不多。所以略講。

      1、流動(dòng)相配制的計算

      流動(dòng)相在HPLC中起到運輸樣品的作用。而流動(dòng)相準確地配制,在HPLC測試中有著(zhù)重要的作用。準確地配制流動(dòng)相能夠保證測試中保留時(shí)間的重復性。所以,配制起來(lái)不能掉以輕心。

      對于流動(dòng)相配制,我把它概括為以下幾個(gè)字。

      計算,稱(chēng)量,溶解,調節,<混合>,過(guò)濾,脫氣。為什么我把“混合"外加了個(gè)框呢?這就是涉及到你的設備是否是單元泵還是多元泵的問(wèn)題了。如果只有一臺單元泵,也無(wú)電磁閥切換功能的泵,需要混合這個(gè)步驟,而多元泵,或者低壓梯度切換的,可以不需要所謂的混合。各走各的。

      打個(gè)比方說(shuō),如果我的流動(dòng)相是:甲醇:純水=60:40(v/v),對于單元泵,那么只能甲醇和純水混合,作為流動(dòng)相,而多元泵或者多元梯度泵,則可以有兩路,A路放甲醇, B路放純水,A與B各比例控制為60%,和40%。

      對于HPLC 配制流動(dòng)相,要保證流動(dòng)性配制準確,也要保證流動(dòng)相配制足量,不多不少,這樣保證在這批測試中,流動(dòng)相不至于不夠,也不致于太多而浪費,流動(dòng)相一般需要在2-3天內用完。那么首先確定流動(dòng)相要配制多少。舉一個(gè)例子。

      要分析30個(gè)樣品,10個(gè)對照品,樣品和對照品都分析2次。一個(gè)試樣分析20分鐘,流速為1.2ml/min。那么我要配制多少ml的流動(dòng)相呢?通過(guò)計算來(lái)解決。(注:自動(dòng)進(jìn)樣,連夜分析,可以設置停止泵程序)

      一般來(lái)說(shuō),試樣設置20分鐘,還需要考慮進(jìn)樣的時(shí)間。假設進(jìn)樣時(shí)間為三分鐘,那么一個(gè)試樣所需要的時(shí)間為23分鐘。我們可以計算:

      根據計算,需要配制2208ml流動(dòng)相。對于流動(dòng)相,我們不能配制得太摳,需要考慮到吸濾頭占的空間,那么我們再多配制個(gè)100-300ml,這取決于你的瓶底胖瘦。能夠保證不被吸空為宜。那么我們就配制2500ml吧。

      對于流動(dòng)相如何配制,我們給一個(gè)實(shí)例

      比如我要測試中藥一清膠囊,我們翻閱中國藥典,得以下信息。

      一清顆粒是由黃連,大黃,黃芩(qin)組成。一般用于清熱瀉火解毒,化瘀涼血止血。用于火毒血熱所導致的身熱煩躁,目赤口瘡,咽喉牙齦腫痛,大便秘結,吐血,咯血咽喉炎,扁桃體炎,牙齦炎等上述癥候者。

      其中黃芩主要成分黃芩苷用HPLC方法測試。先摘入如下:

      色譜條件與系統適應性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,以甲醇-0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH=2.7)(42:58 v/v)為流動(dòng)相,檢測波長(cháng)為275nm。有效塔板數按黃芩苷峰計算不低于5000

      我們看到,其流動(dòng)相是:甲醇-0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH=2.7)(42:58 v/v),那么也就是說(shuō)有水相識0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液,其pH=2.7(用磷酸調節),有機相是甲醇。

      要注意,對于HPLC用的試劑,水,溶劑,都是需要好的。試劑一般在分析純以上。最好用優(yōu)級純,溶劑一般用HPLC級別。水用超純水。所有的溶劑,溶液,都需要用0.45微米(或更細)的微孔濾膜濾過(guò)。也要保證溶劑瓶清洗干凈。干燥。

      流動(dòng)相脫氣是很重要的,現在一般的儀器都有在線(xiàn)脫氣。當然,在配制流動(dòng)相前脫氣,亦重要。一般脫氣又抽真空脫氣,超聲波脫氣,吹He脫氣,加熱回流脫氣等。常用的是前兩個(gè)脫氣方法。當然,抽真空脫氣效率比較高,但是要注意有機相是否在抽真空后比例改變的問(wèn)題。所以,對于混合兩相的流動(dòng)相,最好單獨濾過(guò),再混合?;旌虾笠话銜?huì )產(chǎn)生氣體,用效率略低的超聲波脫氣即可。超聲波脫氣,只要看到無(wú)明顯氣泡即可使用。

      二.含量計算

      對于HPLC,我們一般使用外標法計算。那么有同學(xué)問(wèn),那么為什么內標法很少在HPLC上使用呢?

      那么我們看下氣相色譜和HPLC不同的進(jìn)樣方式。GC手動(dòng)進(jìn)樣還是依靠進(jìn)樣針的定量進(jìn)樣,因為進(jìn)樣量很少,以微升計,所以,稍稍不留神,就有可能多進(jìn)或者少進(jìn)樣。而且,進(jìn)樣針上的刻度也很粗,所以,GC用手動(dòng)進(jìn)樣,使用外標法確實(shí)很考驗測試者的嫻熟技巧和過(guò)人的眼力。而內標法在GC進(jìn)樣測試中,由于內標物的調節作用,可以使得由于進(jìn)樣誤差降低到最小,其相關(guān)的文章,查閱qinqingcao在本論壇的文章。但是HPLC進(jìn)樣是六通閥進(jìn)樣,其有一根定量環(huán),如果手動(dòng)進(jìn)樣能夠保證定量環(huán)是充滿(mǎn)樣品溶液的,那么進(jìn)樣誤差就幾乎不存在。況且內標法需要尋找合適的內標物質(zhì),同時(shí)配制內標物,比較麻煩,所以在HPLC中很少聽(tīng)說(shuō)用內標法定量計算。更多的,是使用外標法計算。

      所以,HPLC手動(dòng)進(jìn)樣一般使用3倍量的定量環(huán)進(jìn)樣。也就是說(shuō),20微升的定量環(huán),我要注入60微升以上的樣品溶液。保證定量環(huán)中充滿(mǎn)著(zhù)樣品溶液。而多余的樣品溶液會(huì )被排除。這樣保證每次進(jìn)樣都是定量環(huán)中的那些量。對于定量環(huán),這個(gè)體積一般也不是正好是20.00微升,但是我們保證進(jìn)樣過(guò)量(多余的溶液會(huì )被排出),則能夠保證進(jìn)樣都是按照定量環(huán)中的體積進(jìn)入色譜系統,這樣消除進(jìn)樣的誤差。對于定量環(huán),在做完樣品后需要用無(wú)溶質(zhì)的流動(dòng)相清洗數遍。如果定量環(huán)真的很臟,無(wú)法清洗了,那么可以裁剪一段管徑和定量環(huán)相同的干凈的不銹鋼管,裁剪長(cháng)度和定量管相同,安裝上去。當然資金充裕的話(huà),也可以購買(mǎi)廠(chǎng)家的定量環(huán)。

      當然現在自動(dòng)進(jìn)樣器很普及,那么使用自動(dòng)進(jìn)樣器就更加方便了。

      對于外標法,實(shí)際上也就是用已知濃度的對照品(標準品)來(lái)對樣品中的該物質(zhì)。這實(shí)際上很象砝碼和天平。標準品就如同砝碼,在同樣的色譜條件下,標準品的峰面積和濃度已知,而樣品中的峰面積可以測試出來(lái),這樣通過(guò)比例式子比較出樣品中該物質(zhì)的濃度了。

      在這里,我想和大家說(shuō)明的是,一般是通過(guò)保留時(shí)間做定性的。比方說(shuō),我測試維生素C,維生素C標準品在一定的色譜條件下,其保留時(shí)間為2.4分鐘;樣品在同樣的色譜條件下,2.4分鐘有峰,一般認為是樣品中也許有維生素C。當然,保留時(shí)間定性確實(shí)有其局限,但是沒(méi)有其他手段,那么保留時(shí)間還是能夠發(fā)揮定性的作用。

      對于定量,外標法定量,如果做的準確的話(huà),需要用多點(diǎn)(濃度)定量。然而在企業(yè)用單點(diǎn)法定量還是很多的。對于做線(xiàn)性,精密度,回收率,這些內容我們在方法學(xué)驗證中講授,這里我還是著(zhù)重講解單點(diǎn)法校正。

      在講單點(diǎn)法校正,我先問(wèn)同學(xué)們一個(gè)問(wèn)題,如何用簡(jiǎn)單的方法來(lái)測試校園中的樹(shù)高度?

      通過(guò)一根已知高度的biao桿,在太陽(yáng)下投射在地面的陰影的長(cháng)度,計算出樹(shù)的高度。同樣道理,我們也是用已知的標準品的濃度和峰面積,用樣品中同一物質(zhì)的面積,計算出樣品中的那個(gè)物質(zhì)的濃度。根據稀釋倍數計算出樣品中,該物質(zhì)的含量。

      如果與標準曲線(xiàn)聯(lián)系起來(lái),這個(gè)就是單點(diǎn)法。也就是說(shuō),以0為圓心,標準品濃度和面積在二元坐標的一點(diǎn)的連線(xiàn)作為校準曲線(xiàn)。得y=ax 其中的a就是斜率,也就是面積隨著(zhù)濃度的變化而變化,其變化率為a。

      那么樣品濃度的計算,就是按照其峰面積在坐標上的點(diǎn),對應的濃度。用以下公式計算。

      單點(diǎn)法:

      我們給出一個(gè)例題。

      測試果汁中維生素C含量。配制20mg/100ml的維生素C作為標準品。稱(chēng)取20.005g果汁到50ml容量瓶中,加入流動(dòng)相溶解定容搖勻。濾紙過(guò)濾。吸取濾液10ml到50ml容量瓶中。流動(dòng)相定容搖勻。標準品和樣品均吸取20μl進(jìn)色譜,分別得到峰面積24336(標準品),20129(樣品)。計算果汁中維生素C含量(mg/100g)

                                                                                                                                             本篇轉載至液相色譜之家

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